窒素固定菌はニトロゲナーゼ（Nitrogenase）という酵素を使って、窒素分子をアンモニアへと変換します。炭化水素のC-H間の結合エネルギは約100 kcal/mol程度であるのに対して、N≡Nの三重結合のエネルギは225 kcal/molと高いので、これを還元的に開裂して2分子のアンモニアに変換することは大変なことです。Hoffman教授はニトロゲナーゼを“Everest of enzyme”と呼んだそうです（2009年）。ニトロゲナーゼは、モリブデンMoを含むMo型、バナジウムVを含むV型それに鉄Feのみを含むFe型の三種類あります。特に、土壌細菌のアゾトバクタ・ヴィネランディ（vinelandii）のMo型ニトロゲナーゼがモデル細菌となっています。ニトロゲナーゼは以下のような反応を触媒します。ここでPiはリン酸を表します。

• N₂ + 8H^＋ + 8e^－ +16Mg²⁺≡ATP + 16H₂O ——> 2NH₃ + H₂ + 16Mg²⁺≡ADP + 16Pi

電子はフェレドキシンなどの電子供与体から提供されます。ギブスエネルギの変化は

• ΔG’ = -136 kcal/mol N2

です。標準状態（PH7）にも関わらず大きな発熱を生じます。細胞での酵素反応中にATPは、Mg²⁺≡ATPの状態を取っています。つまりMg²⁺はATPの2つのリン酸の酸素イオンO^－にキレ－ト結合しています。ATPの負電荷を覆うことで、Mg²⁺≡ATPが酵素反応の活性部位の疎水性の裂け目に結合できます。上記反応ではアンモニアに伴い水素が発生しています。ニトロゲナーゼは、ATPの加水分解と共役したプロトン還元の副反応

• 2H^＋ + 2e^－ + 4ATP + 4H₂O　——> H₂ + 4ADP + 4Pi

が含まれているからです。実際の生理状態においては16ATPではなく、20~30ATPが必要だとされています。ニトロゲナーゼは、反応特異性が低く、様々な窒素化合物や有機化合物を触媒できます。