新型コロナウイルスのPCR検査には主にTaqManプローブ法による定量RT-PCRが用いられています。TaqManプローブ法は、DNAプローブの5’端に蛍光色素（Reporter）、3’端に消光色素（Quencher）を結合させた蛍光標識されたDNAプロ－ブ（TaqManプロ－ブ）を用いる方法です。一本鎖のDNAの標的配列の3’端側に前方プライマ－、5’端側にTaqManプローブが結合します。アニ－リング段階でPCRプライマ－の伸長反応が進むと、Taqポリメラ－ゼ（DNA合成酵素）が移動して、TaqManプローブに接触します。Taqポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によりTaqManプローブが加水分解され、塩基がバラバラになります。その後PCRプライマ－の伸長反応が進み、後方プライマまでDNAが合成されます。レポーターとクエンチャーの距離が離れるので蛍光シグナルが発せられます。蛍光強度を検出することで標的配列の複製量を推定できます。プローブの消光作用は双極子-双極子機構によるFRET quenchingです。消光距離は1～10nmで分子同士の接触は必要ありありません。

TaqManプローブ法はプライマー二量体の非特異的な検出がない利点があります。複数のプローブに別の蛍光物質を標識しておけば、マルチプレックス解析を実行できます。

FRETプローブ法

  FRETとは、蛍光共鳴エネルギー転移（Fluorescence Resonance Energy Transfer）のことです。目的mRNAに特異的な２本のオリゴヌクレオチドのうち、一方の３’末端に蛍光物質A、もう一方の５’末端に蛍光物質Bが修飾されているFRETプローブを用いる手法です。  この2本のオリゴヌクレオチドが、PCR産物に同時にハイブリダイズすると蛍光物質Aの蛍光で蛍光物質Bが励起されることで強い蛍光を発すること利用して測定します。

 

ヘアピンプロ－ブ法

ターゲットにハイブリダイズする際に、ステム・ループ構造を有するヘアピン型プローブが引き伸ばされるとクエンチング効果が解け、蛍光を発する測定方法です。蛍光物質はフルオレセイン(6-FAM)、クエンチャーは DABCYL が用いられます。ステム・ループ構造プロ ーブの消光作用は電子交換機構を原理とした 衝突的消光（Collisional quenching）と呼ばれています。有効距離は 0.3～1nm で、これは蛍光物質とクエンチャーの電子軌道が重なる距離です。